-
Mae microsgop confocal yn cyfeirio at fath o ficrosgop optegol arbennig a all recordio tafelli optegol.
Trwy oleuo ac arsylwi un pwynt terfyn diffreithiant, gwireddir sleisio optegol mewn system confocal laser. Mae hyn yn gofyn bod gan y ddau segment trawst yr un ffocws, felly maen nhw'n "confocal". Yn wahanol i ddelweddau maes eang, nid oes gan ddelweddau confocal unrhyw aneglurder defocol. Mae hyn yn fantais ynddo'i hun, oherwydd mae delwedd ddwfn y sampl yn glir ac yn gyfoethog o ran manylion. Fodd bynnag, y fantais bwysicaf yw ei botensial delweddu tri dimensiwn gyda nodweddion microsgopig. Ar ôl i ddilyniant y ddelwedd gael ei gaffael ar hyd y pentwr Z, mae'r gwrthrych 3D yn cael ei ailadeiladu a'i arddangos gan y cyfrifiadur.
- Goleuadau confocal
Gwireddir goleuo ffynhonnell golau pwynt trwy ganolbwyntio'r ffynhonnell golau ar agorfa fach (twll pin) ac yna ei ganolbwyntio ar y sampl. Pan fydd yr agorfa'n ddigon bach, dim ond gan ddiffreithiant y mae'r pwynt goleuo wedi'i gyfyngu, nid gan baramedrau geometrig ffynhonnell golau ac agorfa. Mae ffynhonnell golau cyffredin yn ffynhonnell golau arwyneb mawr, felly mae'n amhosibl ei ganolbwyntio ar y man terfyn diffreithiant. Felly, er bod y trawsyriant yn isel iawn, mae'r math hwn o olau goleuo â ffocws yn dal i fod yn angenrheidiol iawn (ar gyfer ffynonellau golau traddodiadol).
Ffigur 1: Goleuo ar gyfer delweddu confocal. Mae'r golau o'r ffynhonnell golau (LS) yn canolbwyntio ar y twll pin goleuo (PI) ac yna'n mynd i mewn i'r sampl S.
Mae gan laser fel ffynhonnell golau collimation uchel iawn (mae'r golau mewn laser da yn "hynod gyfochrog"). Felly, gellir canolbwyntio ar y laser ar fan a gyfyngwyd â diffreithiant trwy lens sengl heb ddefnyddio twll pin. Felly, nid oes gan y mwyafrif o ficrosgopau confocal dwll pin goleuo. Mae ansawdd y man ysgafn yn dibynnu ar ansawdd trawst y laser. Os nad yw'r ansawdd yn dda, gallwch hefyd fewnosod y twll pin goleuo. Mae'r laser fel arfer wedi'i gyplysu â'r microsgop confocal trwy ffibr optegol. Mae'r ffibrau hyn eu hunain hefyd yn gweithredu fel tyllau pin.
Mae ffocysu a dwysedd ynni uchel laser yn ei wneud yn ffynhonnell golau ddelfrydol ar gyfer microsgop confocal. Nid yw cydlyniant laser yn nodwedd ofynnol o berfformiad confocal. I'r gwrthwyneb, mae'n her i ddylunwyr optegol, oherwydd bydd yn achosi patrymau ymyrraeth ffug, felly mae angen strategaethau dylunio gofalus.
Yn ogystal, mae gan y ffaith bod y laser traddodiadol yn allyrru un lliw yn unig (laser- "llinell") ei gyfyngiadau ei hun. Mewn delweddu a mesur aml-fflwroleuedd, mae angen trefniant aml-laser cymhleth. Mae laser gwyn yn datrys problem delweddu aml-liw yn fedrus.
Ffigur 2: Cymhariaeth o ddelweddu confocal (arwynebedd cywir) a di-anghyson. Yn Nhrophoblast Llygoden Lliw Feulgen. Nid yw llawer o wybodaeth am ddelweddau nad ydynt yn anghyson yn dod o awyren ffocal. Mae opteg confocal yn dileu'r holl ffactorau niwlog ac yn gwneud y strwythur yn glir.
Canfod confocal
Mae gan y mwyafrif o synwyryddion ardal eithaf mawr sensitif (mae tiwbiau ffotomultiplier fel arfer sawl centimetr sgwâr). Mae angen synhwyro pwyntiau opteg confocal. Felly, mae angen perfformio canfod yn y fan a'r lle trwy fewnosod agorfa fach (twll pin) yn y trawst ysgafn. Canolbwyntio golau'r sampl ar y twll pin, casglu a recordio'r golau a drosglwyddir.
Oherwydd bod y patrwm diffreithiant yn dibynnu ar yr agorfa rifiadol a'r donfedd, mae angen canfod twll pin. Felly, pan fydd y paramedrau hyn yn newid, rhaid addasu maint y twll pin.
Pan fydd y lens gwrthrychol yn newid (fel arfer gyda newid agorfa rifiadol), bydd microsgop sganio confocal modern yn newid diamedr y twll pin yn briodol yn awtomatig. Felly, mae tyllau pin fel arfer wedi'u cynllunio fel agorfeydd dwbl neu aml-haen.
Mewn gwirionedd, mae maint priodol twll pin yn dibynnu nid yn unig ar donfedd ac agorfa rifiadol, ond hefyd ar chwyddhad mewnol elfennau optegol mewn microsgop.
Felly, mae nid yn unig yn annymunol ond hefyd yn anghywir cymharu diamedrau twll pin yn uniongyrchol mewn microsgopau â gwahanol ddyluniadau. Os nad yw diamedr y twll pin wedi'i osod i'r gwerth gorau posibl, ni fydd y system yn gallu perfformio sleisio optegol yn llyfn (hynny yw, trosglwyddo aneglur defocws), na thorri'r dwyster i ffwrdd yn ddiangen heb gael ansawdd sleisio optegol pellach (gan arwain at ddelweddau sŵn diangen).
Ffigur 3: Canfod mewn delweddu confocal. Mae'r golau o'r samplau s yn canolbwyntio ar y twll pin arsylwi (PO) ac yna ar y synhwyrydd de.
Llwybr optegol sganio confocal
Dim ond y cyfuniad o oleuo ffynhonnell pwynt a chanfod pwyntiau yw'r llwybr trawst confocal mewn system sganio confocal. Gellir defnyddio'r cyfuniad hwn fel cyllell optegol. Dim ond ffotonau o'r awyren ffocal y gellir eu trosglwyddo i'r synhwyrydd. Tra bod pob ffoton o leoedd eraill yn cael eu hidlo allan. Mae sleisio optegol yn cael ei wireddu trwy "hidlydd gofodol".
Oherwydd mai dim ond un man sy'n ymddangos yn ddelweddu "confocal" mewn amser penodol, mae angen dyfais sganio i symud y fan a'r lle ar y maes gwrthrych mewn modd grid. Fel arfer, mae'r drych optegol wedi'i osod ar y modur sganio a'i ddefnyddio i gyflawni'r weithdrefn sganio. Mae tagfa yn yr amser sy'n ofynnol i sganio ffrâm lawn (fel arfer) 1,024 llinell. Cyflawnwyd gwelliannau trwy gyflwyno sganiwr cyflym (sganiwr cyseiniant) sy'n sganio 8, 000 neu fwy o linellau yr eiliad.
Dim ond o dan dechnoleg microsgop golau wedi'i adlewyrchu y gellir cyflawni tafell optegol dda. Dyma un o'r rhesymau dros ddatblygiad egnïol microsgopeg fflwroleuedd yn ystod yr 20 mlynedd diwethaf (mae rhesymau eraill yn cynnwys dyfeisio imiwneiddiad, DNA-hybridization, biosensor fflwroleuol, dotiau cwantwm a phrotein fflwroleuol).
Ffigur 4: O'r chwith i'r dde: 1. Mae'r côn goleuo nid yn unig yn cyffroi'r llifyn fflwroleuol yn yr awyren ffocal, ond hefyd yn ei gyffroi i fyny ac i lawr. Yma wedi'i gynrychioli gan gôn dwbl gwyrdd. 2. Mae'r twll pin allyriadau i bob pwrpas yn rhyng -gipio'r golau sy'n cael ei ollwng o uwchben yr awyren ffocal. 3. Yn ogystal, ni fydd y golau o dan yr awyren ffocal yn pasio trwy'r twll pin. 4. Yn y system confocal, dim ond y golau o'r sampl fydd yn cyrraedd y synhwyrydd. Bydd canfod tyllau pin yn gwrthod unrhyw olau o feysydd eraill i bob pwrpas. Yn olaf, ceir yr adran optegol go iawn.
